。下午1點40分，日本聯合艦隊終於發現俄國艦隊的影子。8點55分，東鄉平八郎在旗艦“三笠”號上升起“Z”字旗，發出了“皇國興亡在此一戰，各員勵精努力”的號令，同時艦隊大角度轉向，與俄國艦隊形成“丁字形作戰”隊形，堵住了俄國艦隊的去路。雙方艦隊相距8,000米，俄國艦隊利用日本艦隊轉向的有利時機首先開炮，但炮擊目標缺乏精度。日本艦隊到相距6,000米時才打開炮門。於是，從拿破侖戰爭到第一次世界大戰期間世界海戰史上最大的一次海戰——日本海大海戰就這樣爆發了。
經過30分鐘激戰，波羅的海艦隊旗艦“蘇沃洛夫”號、2號艦“亞曆山大三世”號和5號艦“奧斯裡亞別亞”號3艘戰艦相繼起火，脫離戰鬥行列。到日暮時，俄國艦隊的主力艦幾乎全部被擊沉或受重傷，這場空前規模的大海戰勝負已成定局。
高野五十六在27日傍晚受傷。由於“日進”號是第1戰隊的旗艦，遭到俄艦隊炮火的集中攻擊。擔任艦長傳令兵的高野五十六站在艦橋上擔任記錄，此時艦上已有人死傷。
在27日白天的戰鬥快要結束的時候，“日進”號突然被俄國人的炮彈擊中。高野五十六後來這樣寫道：“轟隆一聲巨響，剩下來的203毫米口徑艦首左炮被俄國人的重炮擊中。艦上頓時硝煙彌漫，遮住了戰艦的前半部分。一股巨浪猛烈襲來，我不覺踉蹌幾步，左手手指嚓地一下折斷兩根，隻連著一點皮。掛在脖子上的記錄板也不翼而飛了。同時左腿也被彈片削去巴掌大的一塊肉，鮮血染紅了甲板。”
此役，“日進”號死傷人數近100名，而高野五十六也在其中，實現了他為天皇效忠的理想。
為表彰高野五十六作戰勇敢，1906年4月10日，天皇授予他六等功勳旭日章，並頒發獎金350日元。
這段經曆對他是如此重要，以致他在後來曾專門撰文寫道：“我從海軍軍官學校畢業不久就碰上了日俄戰爭，作為一名海軍士官，能夠獲得實戰經驗實在是幸運的。當時我受命在三須中將閣下乘坐的第1戰隊旗艦‘日進’號擔任艦長的傳令兵，在前艦橋寫戰鬥報告是我的任務。
怎麼也無法忘記，在敵艦隊投降的前一天，即明治三十七年（1905年）5月27日，以國運相賭的大決戰在日本海開始了。有不少戰友受傷。就在那一天，一發炮彈飛來，被擊中的艦橋碎片打傷了我的左腿，並奪去了左手二指。在那一刹那間，我沒有感到絲毫不安，隻想到一個人在其崗位上應儘自己最大的努力。從那之後，雖然經過了30年的歲月，但這一信念一直未變。”
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正是這一信念支配著他，一步步忠實地執行了日本軍國主義對外擴張的計劃，並在這一過程中得以步步高升。
日俄戰爭兩年後，高野五十六升任中尉，又過了兩年，升任大尉，成為訓練艦隊宗穀分隊的指導官，負責來艦上進行遠洋實習的少尉候補生的業務指導。此時的高野五十六，最引人注目的是他深思熟慮而果敢行動的性格。
平常沉默寡言，認真指導候補生，默默地履行分隊長的職務，在指導官開會時也很少發言，但他總是一鳴驚人，建議經常被艦隊采納。後來，他隨艦遠航到中國的珠江口和廣州灣一帶，並到過北美、澳大利亞。
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