937年9月才組建完成，後來進行訓練也不到1個月。1937年10月，這支雜牌武裝隊就走上了戰場，他們分布在上海南市和蘇州河兩岸，配合國民黨正規軍對日作戰。
按說這支隊伍的作戰能力是比較差的。他們被倉促武裝起來，幾乎沒有接受過什麼作戰訓練，根本不會打仗。可事實上，他們的戰鬥力大得驚人，令杜月笙和戴笠都特別意外。其實仔細分析一下原因，也就並不會覺得奇怪了。
首先，雖然別動隊是雜牌軍，人員情況複雜，三教九流的都有，但隊伍中從大到小的所有領導人，都是杜月笙和戴笠等安插的“正規軍”，比如黃埔軍校的軍官、久經戰場的老兵等。有這些人的領導，別動隊就不會是一盤散沙了，兵力自然強了不少。
其次，雖然許多別動隊員連作戰武器都不大熟悉，機關槍、大炮等重型武器根本不會用，但他們配備的基本上就是操縱簡單的手槍，這個用起來很方便。而杜月笙的那些幫會會員，平日裡經常參與幫會的“火拚”，都慣用手槍，於是，他們就成了戰鬥力最強的別動隊員。
第三，隊員們的主要任務是配合正規軍，所以他們的活動範圍基本上在上海市區。這些人大多是上海本地人或在上海生活多年的人，他們熟悉地形，在與日寇的巷戰中行動非常靈活。
第四，從整體上看，淞滬戰役中，日軍占據優勢，蔣介石的正規軍節節敗退，令全國人民都很失望。而戰場前沿的上海人，即使是地痞流氓，也有一腔熱血，為了保衛自己的家園，他們都願意上戰場打日本人。
別動隊參戰初期，傷亡不大。隊員們滿懷著高昂的愛國熱情，頑強抗擊日軍。他們不同於正規軍的優勢，也充分發揮出來了。比如來自青紅幫的隊員們擅長巷戰，來自上海各工廠的隊員們則很會修築防禦工事。來自軍統局的隊員們手段就更多了，提供情報、設置陷阱等，這些都對抗戰很有幫助。
剛開始，武裝隊主要負責運送彈藥糧草、運送傷員等後勤工作。不過很快，他們就正式與日軍硬碰硬了。別動隊員出現大批傷亡，也是從這時開始的。
1937年11月5日，10萬日軍精銳部隊突襲杭州灣金山衛。這裡國民黨軍隊防守薄弱，日軍突襲成功，並順利登陸，接著就包抄淞滬南線的中國軍隊。此後，中方在淞滬戰役中開始全線潰敗，戰火徹底蔓延到了上海市區。
蔣介石在淞滬戰場投入了六十多萬兵力，如今他見形勢對己方特別不利，就打算放棄上海，以保存實力。11月8日，蔣介石下達了全麵撤退的命令。蘇浙別動隊則擔負起掩護國民黨主力軍撤離上海的重任。
其中第三、第五支隊配合國民黨第五十五師的一個旅，在上海南市掩護撤軍。從11月8日深夜開始，至11月11日國民黨軍主力部隊全部撤離上海，別動隊員們奮戰了三天三夜。在這硝煙滾滾的戰幕下，在敵寇的瘋狂進攻下，別動隊人人奮不顧身，頑強抵禦敵人的槍炮。有的隊員子彈打光了，竟與日軍展開了肉搏戰。一批又一批的隊員，壯烈犧牲在淞滬戰場上。在他們的努力下，日軍雖重兵出擊，最終也沒有攻下上海南市。這一戰果是用那些別動隊烈士們的鮮血換來的。
南市區位於上海浦東，第一、第二支隊也在這裡擔任掩護任務，傷亡都很大。5支別動分隊中，有3支是杜月笙的徒子徒孫們組成的，因此杜月笙的損失最大。他雖做過不少壞事，但對自己的門徒一向優厚，如今他都無顏向幫會和烈士家屬交代了，以致日日悲痛不已。此後，直到杜月笙去世前，每逢想起此事，杜月笙都悲痛欲絕，深深懷念那些為國捐軀的門生。
另外，第四支隊渡過蘇州河去，掩護國民黨主力軍撤退。這一支別動分隊是由軍統特工組成的，傷亡比南市更慘重，以致戴笠領導的軍統局很長時間都沒法恢複元氣。
11月11日，國民黨主力成功撤出上海。這天下午，一批圓滿完成掩護任務的別動隊員紛紛奔向法租界。杜月笙早已分派人手，在各個路口等著他們。按照法租界的規定，華人不得攜帶武器進入租界。於是，在法國兵或巡捕們的監督下，別動隊員們挨個交出槍支彈藥，恢複自由身，去與家人親友團聚。這善後的工作，杜月笙早就安排好了。不過看到許多走上戰場的門生都沒有回來，他神色黯然。
國民黨軍隊撤離後，還有不少別動隊員們繼續頑強作戰。
其中第三和第五支隊就撤離得最晚。這兩個支隊共有五千來人，支隊長分別是朱學範和陶一珊，其中陶一珊任總指揮。在陶一珊的領導下，他們又奮戰了幾天。將士們不分晝夜的作戰，可口糧卻供應不上，還是戴笠派出自己的偵查組長周偉龍送去了2萬個麵包，才解了燃眉之急。
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