常洛深知自己能順利即位，離不開王喜姐的支持，因此對她極為孝順，幾乎每天都會去慈慶宮請安。王喜姐則叮囑他“勤政愛民，任用賢能”，不要重蹈萬曆帝怠政的覆轍。可誰也沒有想到，朱常洛即位僅一個月，就因為服用了鄭貴妃進獻的“紅丸”而病逝，史稱“紅丸案”。這個消息傳來時，王喜姐正在佛堂為朱常洛祈福，聽到消息後，她手裡的佛珠突然斷裂，珠子散落一地。她踉蹌著走出佛堂，看著前來報信的太監，聲音顫抖地問：“是鄭貴妃乾的？”太監點了點頭，說：“陛下服用紅丸後，立刻腹痛不止，不到一個時辰就駕崩了。”王喜姐閉上眼睛，兩行清淚滑落——她拚儘全力守護的國本，竟然如此脆弱。
朱常洛去世後，他的長子朱由校即位，是為明熹宗。朱由校尊王喜姐為“懿安皇後”，將她遷居仁壽宮。此時的鄭貴妃雖然失去了靠山，但依舊在後宮興風作浪，試圖拉攏朱由校的乳母客氏，乾預朝政。王喜姐得知後，多次召見朱由校，告誡他“遠離奸佞，親賢臣”，還揭露了鄭貴妃和客氏的陰謀。朱由校雖然年幼，但也明白王喜姐的苦心，逐漸疏遠了客氏和鄭貴妃。可此時的明朝，已經內憂外患——朝堂上，東林黨與閹黨爭鬥不休；邊境上，後金虎視眈眈；民間，農民起義此起彼伏。王喜姐雖然身處後宮，但也時刻關注著國家大事，她常常將自己的積蓄捐出來，充作軍餉，還多次勸說朱由校“節儉度日，體恤百姓”。
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天啟七年，朱由校病逝，他的弟弟朱由檢即位，是為崇禎帝。崇禎帝對王喜姐極為敬重，不僅時常向她請教朝政，還尊她為“皇嫂懿安皇後”，給予了她極高的禮遇。王喜姐見崇禎帝有“中興之誌”，十分欣慰，她將自己多年在後宮積累的經驗和對朝堂局勢的看法，一一告知崇禎帝。她提醒崇禎帝“要平衡朝堂勢力，不要輕信閹黨，也不要過度打壓東林黨”，還建議他“整頓吏治，減輕百姓賦稅”。崇禎帝對王喜姐的話深信不疑，即位之初就鏟除了魏忠賢等閹黨勢力，重用了一批有才能的大臣。
崇禎十七年三月，李自成率領的農民起義軍攻破北京。消息傳來時，王喜姐正在仁壽宮梳妝。她看著銅鏡中自己蒼老的麵容，想起了六十多年前那個在通州府邸描眉的少女，想起了母親給她的那枚玉玨，想起了萬曆帝、明光宗、明熹宗，想起了這座見證了她一生悲歡的紫禁城。宮女勸她“趕緊逃走，尋找生路”，她卻搖了搖頭，平靜地說：“我是明朝的皇後，當與明朝共存亡。”她取下頭上的鳳冠，換上一身素服，又將那枚玉玨戴在手上，然後從容地自縊身亡，享年七十七歲。
王喜姐去世後，崇禎帝為她舉行了隆重的葬禮，將她與萬曆帝合葬於定陵。可誰也沒有想到，僅僅幾天後，崇禎帝就在煤山自縊身亡，明朝滅亡。後來，清朝統治者為了拉攏漢族民心，下令修繕了定陵，並追諡王喜姐為“孝端貞恪莊惠仁明媲天毓聖顯皇後”。
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